Comment pouvons-nous vous aider ?
Quelques réponses aux questions fréquemment posées sur l'endonucléase Benzonase®
Sur quel type d'acide nucléique fonctionne l'endonucléase Benzonase® ? S'utilise-t-elle lors de l'isolation de l'ARN ?
L'endonucléase Benzonase®est une endonucléase qui attaque et dégrade toutes les formes d'ADN et ARN (un brin, double brin, linéaire et circulaire).
A quelles fins utiliser l'endonucléase Benzonase® ?
Cette question n'a pas de réponse générale. For the case at hand, the optimum conditions have to be determined experimentally. Il existe plusieurs paramètres qui influencent l'activité de l'endonucléase Benzonase® . Néanmoins, les conditions optimales varient selon le procédé et doivent être expérimentées de manière expérimentale.
Les applications incluent : réduction de la viscosité pour faciliter le traitement à venir (par exemple purification de protéine recombinante, applications sensibles à la viscosité pour lysats cellulaires de mammifères, etc.); réduction de l'agglutination dans les échantillons de cellules mononucléaires sanguines périphériques stockées (PBMC) avant le traitement (voir Perrin 2008 inNovations 28, 21); préparation de corps d'inclusion pour une renaturation réussie de protéine, retrait d'acides nucléiques chargées négativement des échantillons avant SDS-PAGE à deux dimensions, purification d'adénovirus, production d'anticorps monoclonal, purification à grande échelle de vecteurs de lentivirus, etc.
Comment l'endonucléase Benzonase® peut être inactivée ? Comment peut-elle être retirée ?
Une inactivation irréversible peut ne s'accomplir que dans des conditions extrêmes (100 mM de NaOH à 70C pendant 30 minutes). Toutefois, les conditions requises pour la dénaturation des protéines peuvent présenter un danger pour votre produit final. Une inhibition réversible peut s'opérer par complexation d'ions Mg2+ avec EDTA et / ou phosphate.
L'endonucléase Benzonase® peut être séparée / retirée du produit cible lors du procédé en aval grâce à des méthodes de séparation de chromatographie. Selon les caractéristiques de la protéine souhaitée, on utilise un échange ionique, une interaction hydrophobe, l'hydroxylapatite ou la chromatographie sur gel perméable. Si l'on considère une différence significative entre la taille de l'endonucléase Benzonase® et la protéine cible, l'ultrafiltration pourra être utilisée avec succès. L'endonucléase Benzonase® n'est pas ou faiblement liée à des résines d'échange d'anion sous une variété de conditions : pH 7,0 – 9,0 à 50 mM de NaCl. L'endonucléase Benzonase® élude des résines d'échange de cations sous 200 mM de NaCl à un pH 6.0 et n'est pas lié pour affaiblir une résine d'échange de cations à pH 6.0
Il est recommandé d'optimiser le protocole de séparation dans chaque cas spécial par les résultats sus-mentionnés comme directive.
Proposez-vous une endonucléase Benzonase® immobilisée ?
Non. Aucun des efforts pour lier l'endonucléase Benzonase® à un support qui remplit les exigences d'un produit commercial en respect à des exigences d'activité, de stabilité, et réglementaires n'a abouti. Mais, nous n'abandonnons pas.
Est-ce que l'endonucléase Benzonase® peut se priver de l'activité de la protéase ?
Oui, elle est fournie sans activité de protéase requise et ne se dégrade pas lors de “travail”.
L'endonucléase Benzonase® est-elle compatible avec des cocktails inhibiteurs de la protéase ?
Oui. Toutefois, attention dès lors que de nombreux mélanges inhibiteurs de protéase incluent l'EDTA. Des concentrations supérieures à 1 mM d'EDTA vont inhiber l'activité de l'activité de l'endonucléase Benzonase®.
Mon endonucléase Benzonase® est restée sur la paillasse. Est-elle toujours utilisable ?
Nous avons testé de manière extensive la stabilité sur l'endonucléase Benzonase® et avons découvert son extrême stabilité. Même avec des incubations étendues à 37C, l'endonucléase Benzonase® maintenait une activité > 90% pendant plusieurs mois.
Je veux utiliser un tampon différent. Quelles sont les conditions requises pour une activité pleine de l'endonucléase Benzonase® ? Que réduira son activité ?
L'activité de l'endonucléase Benzonase® requiert 1-2 mM de Mg2+. La Benzonase est inhibée (environ 50% de son activité) par des concentrations de cations monovalents >50%, des concentrations de phosphate >20 mM et des concentrations de sulfate d'ammonium >25 mM.
Ma protéine est insoluble et j'ai besoin de réaliser une purification sous conditions dénaturantes. L'endonucléase Benzonase® fonctionne-t-elle dans l'urée ?
L'activité de la Benzonase® diminue en présence d'urée jusqu'à 6 M.
A 6 M d'urée, l'activité enzymatique augmente d'abord, puis décroît avec le temps. A 7 M d'urée, la Benzonase® se dénature après 15 minutes, et perd son activité. Toutefois, une dégradation significative des acides nucléiques s'opère avant l'inactivation. Des concentrations initiales plus hautes de l'endonucléase Benzonase® peut compenser de manière partielle les effets de 7 M d'urée.
Pourquoi avez-vous l'endonucléase Benzonase® en deux qualités de pureté différentes ? Quel est l'impact d'une pureté de 90% versus 99% ?
Afin d'atteindre la gamme la plus large possible d'exigences de procédés et de coûts, l'endonucléase Benzonase® est disponible en deux qualités de pureté différentes : qualité de pureté I (> 99% pure) et qualité de pureté II (> 90% pure). Ces deux qualités sont disponibles à 25 U/µl ou à une forte concentration définie comme 250 U/µl.
Quel est le résultat final d'un dégradation d'acide nucléique complète par l'endonucléase Benzonase® ?
La Benzonase® digère complètement les acides nucléiques en 2-5 bases d'oligonucléotides terminées 5’-monophosphate en longueur.
A quelle étape du procédé dois-je introduire l'endonucléase Benzonase® ?
La réponse à cette question variera en fonction de la raison pour laquelle vous utilisez l'endonucléase Benzonase® . Toutefois, comme règle générale, la Benzonase® est généralement ajoutée après l'étape de fermentation et avant l'étape de capture.
Offrez-vous un kit ELISA pour l'analyse de traces d'endonucléase Benzonase® endonuclease ?
Oui. Un kit ELISA est disponible.
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